Генная терапия наследственных заболеваний
Генотерапию можно применить для лечения многих наследственных заболеваний, особенно аутосомно-рецессивных. В этих случаях мутация обычно препятствует синтезу нормального белка (мутация, вызывающая подавление функции). Для лечения необходимо доставить нормальный ген в пораженные ткани. Этот подход часто называют генной заменой, хотя в действительности мутантный ген не затрагивается. Поэтому более точный термин — генное усиление. Введение дополнительных копий нормального гена в пораженную ткань при доминантном наследовании заболевания часто не приводит к излечению, особенно при доминантно-негативных мутациях. Эти общие принципы генной терапии проиллюстрированы конкретными примерами, приведенными ниже.
Для преодоления наследственного дефекта трансген должен обеспечивать достаточный, хотя и неодинаковый при разных заболеваниях, уровень экспрессии. Этот уровень часто оценивают на основе сравнения тяжести заболевания со степенью генетического нарушения. Например, при гемофилии степень нарушения свертывания крови пропорциональна недостаточности факторов свертывания. В других случаях такие оценки невозможны. Не известно, например, какого уровня экспрессии гена CFTR (ген кодирует белок — регулятор мембранной проводимости) необходимо добиться для достижения лечебного эффекта при муковисцидозе. Еще сложнее случаи, когда требуется тонкая регуляция экспрессии. Примером могут быть талассемии — болезни, обусловленные нарушением синтеза а- или β-цепей глобина. Избыточная экспрессия трансгена, кодирующего одну из цепей, не менее опасна, чем само заболевание.
Корригирующая генотерапия
Для прямой коррекции генетических нарушений (а не просто добавления нормального аллеля) было разработано несколько подходов. Теоретически эти подходы обладают рядом преимуществ; например, одновременно снижается экспрессия мутантного гена и увеличивается вероятность естественной регуляции экспрессии трансгена. Корригирующая генотерапия хорошо подходит для лечения наследственных заболеваний, вызванных доминантно-негативными мутациями.
Первый подход заключается в исправлении мРНК с помощью каталитически активной РНК (рибозима), обеспечивающей транс-сплайсинг (см. ниже). При этом дефектный участок молекулы мРНК заменяется на соответствующий нормальный участок. Второй подход направлен на коррекцию нарушений на уровне генома, для чего применяют специальные РНК/ДНК-олигонуклеотиды. В обоих случаях регуляция экспрессии не нарушается.
Транс-сплайсинг с помощью рибозимов. С начала 1980-х гг., когда была открыта ферментативная активность РНК, рибозимы стали объектом пристального изучения. Многочисленные биохимические исследования были направлены на выяснение структуры активных центров рибозимов и механизмов катализа. Новый интерес к рибозимам вызван их возможным применением в генной терапии.
Рибозимы. Первой известной реакцией, катализируемой РНК, стал аутосплайсинг интрона (интрон группы I) в молекуле рРНК простейшего Tetrahymena thermophila. Эта реакция была подробно изучена, а механизм, посредством которого рРНК вырезает себя из молекулы-предшественника, хорошо известен (Cech, 1993). Затем была открыта РНК-содержащая субъединица рибонуклеазы Р. Этот фермент катализирует удаление 5′-концевой последовательности при созревании тРНК во многих клетках (Symons, 1992). Вторая группа (группа II) интронов, обладающих каталитической активностью, была обнаружена в геноме органелл некоторых низших организмов (Frank and Расе, 1998). Эти интроны не только катализируют аутосплайсинг, но и способны встраиваться в двухцепочечную ДНК с помощью многофункционального белка, кодируемого интроном. Обнаружена каталитическая активность и некоторых других последовательностей РНК, присутствующих в возбудителях болезней растений и животных. Молоткообразные и шпилькообразные рибозимы обнаружены в РНК вироидов и вирусоидов растений. Рибозим обнаружен и в короткой одноцепочечной РНК вируса гепатита D, выделенного от некоторых больных гепатитом В. Каждый из этих небольших рибозимов катализирует реакцию саморасщепления, которая, по-видимому, играет важную роль в репликации одноцепочечных РНК указанных возбудителей (Symons, 1992).
Рибозимы различаются по размеру и механизму катализа. Каждый тип рибозима имеет характерную вторичную и третичную структуру, необходимую для формирования активного центра и осуществления катализа (Cech, 1992). Такие рибозимы, как интроны группы I или субъединица рибонуклеазы Р, обычно содержат более 200 нуклеотидов и расщепляют РНК с образованием З’-гидроксильной и 5′-фосфатной групп. Напротив, молоткообразные и шпилькообразные рибозимы, а также рибозим вируса гепатита D обычно содержат лишь 30—80 нуклеотидов и расщепляют РНК с образованием 2′,3’-циклофосфнт-ной и 5′-гидроксильной групп.
Все эти рибозимы были модифицированы таким образом, чтобы они могли расщеплять определенные последовательности других молекул РНК. Предполагается, что их можно будет применять для специфического подавления экспрессии генов (Rossi, 1999). Кроме того, способность к транс-сплайсингу, возможно, удастся использовать для коррекции дефектных транс-криптов путем замены мутантного участка на нормальную последовательность (рис. 5.4) (Sullenger, 1999).
Коррекцию молекул РНК с помощью рибозимов можно использовать для лечения различных заболеваний. Как уже описано выше, интрон группы I из Tetrahymena thermophila катализирует аутосплайсинг рРНК. Этот рибозим модифицировали так, чтобы он мог путем адресного транс-сплайсинга исправлять укороченные транскрипты lacZв Escherichia coli (Sullenger and Cech, 1994) и в клетках млекопитающих (Jones et al., 1996). В обоих случаях рибозимы с большой точностью вставляли нормальную последовательность в дефектный транскрипт, обеспечивая открытую рамку считывания. В дальнейших исследованиях определяли эффективность коррекции РНК: рибозимы исправляли до 50% укороченных транскриптов lacZ в фибробластах млекопитающих, в которые вводили плазмиды, кодирующие рибозим и исходный транскрипт lacZ (Jones and Sullenger, 1997).
Рисунок 5.4. Исправление и расщепление мРН К с помощью рибозимов. А. Исправление путем транс-сплайсинга. Мутация (замена нуклеотида) в мРН К обозначена Хм, а соответствующий нуклеотид в нормальном экзоне — Хн. Реакция начинается со спаривания комплементарных нуклеотидов между рибозимом (относится к интронам группы I) и м РН К. Затем рибозим катализирует расщепление мРН К и встраивание нормального участка экзона вместо мутантного. Б. Расщепление мРН К с помощью молоткообразного рибозима. Сначала происходит спаривание комплементарных нуклеотидов рибозима и мРНК, а затем расщепление мРНК у неспаренного нуклеотида между двухцепочечными участками I и III. Потом рибозим освобождается и может катализировать следующую реакцию расщепления. ДЦ — двухцепочечный участок.
Было показано, что рибозимы этой группы способны успешно исправлять дефектные транскрипты при распространенных наследственных заболеваниях и злокачественных новообразованиях. Успешный транс-сплайсинг получен для транскриптов, связанных с атрофической миотонией (Phylactou et al., 1998) и серповидноклеточной анемией (Lan etal., 1998), а также для дефектных транскриптов гена ТР53 (Watanabe and Sullenger, 2000).
РНК/ДНК-олигонуклеотнды (химеропластика). Мутации, вызывающие заболевания, можно удалить, активировав клеточную систему репарации ДНК. Химерные РНК/ ДНК-олигонуклеотиды были успешно применены для замены мутантных последовательностей в геноме экспериментальных животных. Этот новый метод генотерапии, называемый химеропластикой, был разработан на основании данных, полученных при изучении гомологичной рекомбинации (Yoon et al., 1996). РНК/ДНК-олигонуклеотиды содержат самокомплементарные последовательности из дезоксирибонуклеотидов и модифицированных рибонуклеотидов (2′-0-метилрибонуклеотидов), образующие дуплексную структуру с двумя концевыми «шпильками» и петлями из политимидина (рис. 5.5). Наличие 2′-0-метилрибонуклеотидов обеспечивает повышенное сродство к последовательностям-мишеням и устойчивость к нуклеазам.
Структура РНК/ДНК-олигонуклеотидов. Обычно распознающая последовательность РНК/ДНК-олигонуклеотидов состоит из двух участков по десять модифицированных рибонуклеотидов и каждом, разделенных пятью дезоксирибонуклеотидами, причем центральный дезоксирибонуклеотид не комплементарен дезоксирибонуклеотиду мутантного участка генома (рис. 5.5). В точке некомплементарности олигонуклеотид служит матрицей для клеточной системы репарации ДНК, восстанавливающей нормальную последовательность. РНК/ДНК-олигонуклеотиды могут также обеспечивать делецию или вставку одного нуклеотида. Обычно длина распознающей последовательности составляет 25 нуклеотидов, но увеличение длины этого участка повышает вероятность коррекции (Gamper et al., 2000).
Механизм действия. Механизм действия РНК/ДНК-олигонуклеотидов до конца не изучен, однако уже получено много данных с использованием бесклеточного экстракта тканей человека (Cole-Strauss et al., 1999; Gamper et al., 2000). Адресное исправление последовательности требует участия двух клеточных механизмов: гомологичной рекомбинации и репарации неспаренных нуклеотидов. Исследования показывают, что промежуточным продуктом реакции является D-петля, в которой РНК/ ДНК-олигонуклеотид связан с комплементарными участками обеих цепей ДНК (рис. 5.5). В ранних исследованиях по химе-ропластике применяли РНК/ДНК-олигонуклеотиды, в которых обе комплементарные цепи шпилечной структуры несли необходимый для замены нуклеотид. В настоящее время считают, что химерная цепь нужна лишь для избирательного и прочного взаимодействия с нужной последовательностью и только ДНК-цепь служит матрицей для замены неспаренного нуклеотида, поэтому только эта цепь должна нести соответствующий нуклеотид. Считается также, что активность молекулы увеличивается, если одна из цепей состоит только из рибонуклеотидов, а не из чередующихся участков РНК/ДНК.
Вначале РНК/ДНК-олигонуклеотиды применяли для адресного изменения внехромосомной ДНК плазмид. Позже было показано, что с их помощью можно исправить последовательность и в геноме культивируемых клеток. В экспериментах in vitro использовали аллель, кодирующий гемоглобин S в культуре лимфобластов, мутантный ген щелочной фосфатазы в линии клеток НиН-7 и ген тирозиназы в меланоцитах мышей-альбиносов (Alexeev andYoon, 1998; Cole-Strauss etal., 1996; Kren etal., 1997).
Рисунок 5.5. Химеропластика. А. Структура химерного РНК/ ДНК-олигонуклеотида. Верхняя цепь химерного олигонуклеотида (верхний олигонуклеотид) содержит гомологичный участок (комплементарный последовательности-мишени), который состоит из двух последовательностей 2′-0-метилрибонуклеотидов (изображены белым), разделенных пятью дезоксирибонуклеотидами. Нижняя цепь полностью образована дезоксирибонуклеотидами. Один из дезоксирибонуклеотидов не комплементарен последовательности-мишени (показан стрелкой). Пары гуанин—цитозин, стабилизирующие структуру концевых «шпилек», и петли из политимидина (Т-петли) препятствуют соединению нескольких олигонуклеотидов с образованием конкатемерных молекул. Позднее были сконструированы химерные РН К/ДН К-олигонуклеотиды (нижний олигонуклеотид), где одна цепь полностью состояла из 2’-0-метилрибонуклеотидов и только в другой был некомплементарный нуклеотид, необходимый для исправления последовательности-мишени. Б. Предполагаемый механизм исправления последовательности ДНК с помощью химерного РНК/ ДН К-олигонуклеотида. Верхний участок олигонуклеотида (черный) прочно связывает его с последовательностью-мишенью. Нижний участок (серый) служит матрицей для замены нуклеотида в геноме с помощью клеточного механизма репарации неспаренных нуклеотидов. Г — гуанин, Ц — цитозин.
Коррекция гена in vivo была впервые получена на крысах линии Gunn (модель синдрома Криглера—Найяра 1 типа), имеющих мутацию со сдвигом рамки в гене глюкуронилтрансферазы. При этой мутации глюкоуронил-трансферазная активность отсутствует и наблюдается гипербилирубинемия (Krenetal., 1999). РНК/ДНК-олигонуклеотид был сконструирован так, чтобы обеспечить адресную вставку утерянного нуклеотида в геномную ДНК. Этот олигонуклеотид вводили крысам в/в в виде комплекса с лактозилированным полиэтиленимином или внутри анионных липосом, после чего он попадал в печень. В 20% случаев происходила репарация гена, а транскрибируемая с него мРНК обеспечивала синтез активного фермента. Концентрация билирубина снижалась на 25% после введения первой дозы и на 50% исходного уровня после второй, что свидетельствует об аддитивном действии дробного введения РНК/ДНК-олигонуклеоти-да. Восстановление активности фермента было подтверждено биохимически, причем лечебное действие сохранялось не менее 6 мес.
В других исследованиях с помощью химеропластики успешно исправляли мутации генов дистрофина у мышей и золотистых ретриверов (две модели миопатии Дю-шенна), а также гена тирозиназы у мышей-альбиносов линии BALB/c (Alexeev et al., 2000; Bartlett et al., 2000b; Rando et al., 2000).
Для применения химеропластики в клинике предстоит выработать оптимальный способ доставки РНК/ДНК-олигонуклеотидов, а также дешевые и эффективные методы их синтеза и очистки (Yeetal., 1998). В большинстве способов доставки используют заряженные липосомы и синтетические полимеры, в том числе полиэтиленимин и полилизин. Наибольшую сложность вызывает доставка РНК/ДНК-олигонуклеотидов в ядро. Из-за длины (обычно 68 нуклеотидов) и очень стабильной вторичной структуры РНК/ДНК-олигонуклеотидов их синтез и очистка в достаточных количествах — сложный и дорогой процесс. Побочные продукты синтеза олигонуклеотидов токсичны, а не полностью синтезированные олигонуклеотиды могут конкурировать с конечным продуктом за места связывания на ДНК. Чаще всего для очистки РНК/ДНК-олигонуклеотидов применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию и электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
Методы инактивации генов
Важным приемом генной терапии многих приобретенных заболеваний, включая вирусные инфекции и злокачественные новообразования, стала адресная инактивация генов. Для этого используют антисмысловые олигонуклеотиды и некоторые типы рибозимов. Специфический антисмысловой олигонуклеотид для лечения цитомегаловирусного ретинита — фомивирсен — первое лекарственное средство на основе нуклеиновой кислоты, одобренное ФДА.
Антисмысловые олигонуклеотиды
Синтетические короткие одноцепочечные молекулы ДНК, комплементарные мРНК, способны блокировать экспрессию определенных генов на уровне трансляции (Galderisi et al.. 1999; Ма et al., 2000). Антисмысловым олигонуклеотидам первого поколения устойчивость к действию нукпеаз придавали фосфоротиоатные связи, отличавшиеся от обычных фос-фодиэфирных связей между нуклеотидами тем, что один из боковых кислородов фосфатной группы заменен на серу (см. ниже). Антисмысловые олигонуклеотиды второго поколения имеют другие межнуклеотидные связи, а кроме того, они построены как из дезоксирибонуклеотидов, так и из модифицированных рибонуклеотидов. Новейшие антисмысловые олигонуклеотиды имеют улучшенные фармакокинетические характеристики и более безопасны, поскольку их неспецифическое действие подавлено (Agrawal and Kandimalla, 2000).
Механизм действия. Антисмысловые олигонуклеотиды обладают специфическим и неспецифическим действием (Galderisi et al., 1999; Ма etal., 2000). В основе специфического действия лежит взаимодействие с комплементарной последовательностью мРНК в соответствии с правилами спаривания нуклеотидов, открытых Уотсоном и Криком. Это взаимодействие прекращает трансляцию мРНК на рибосомах и активирует рибонуклеазу Н — фермент, расщепляющий РНК в дуплексе РНК/ДНК. Обычно антисмысловой олигонуклеотид имеет длину 15—20 нуклеотидов, что достаточно для высокоспецифичного распознавания последовательности-мишени. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды обладают неспецифическим действием, которое не зависит от нуклеотидной последовательности. Олигонуклеотиды представляют собой полианионы, поэтому они могут связываться с различными белками, активировать комплемент или угнетать свертывающую систему крови. Последний эффект может привести к изменению показателей коагулограммы (She
han and Lan, 1998). Антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие определенные последовательности (например, динуклеотиды цитозин—гуанозин или гуанозиновые триплеты), могут вызвать мощный иммунный ответ, включая активацию В-лимфоцитов и образование цитокинов — интерлейкинов, интерферона у, ФНОа и пр. (Pisetsky,1999).
Фармакокинетика. В первых клинических испытаниях, в которых антисмысловые олигонуклеотиды вводили в/в или п/к, обычно отмечали дозозависимое увеличение их стационарной сывороточной концентрации (Levin, 1999). Фармакокинетика обычно не зависит от последовательности нуклеотидов и длины олигонуклеотида. Элиминация после в/в введения осуществляется в пределах 24 ч, главным образом путем почечной экскреции. У экспериментальных животных антисмысловые олигонуклеотиды можно обнаружить в большинстве тканей (кроме мозга) в течение 48 ч. После внутриглазного введения Т| п больше (de Smet et al., 1999).
Фомивирсен. Антисмысловые олигонуклеотиды были разработаны в первую очередь как противовирусные и противоопухолевые средства. Первое лекарственное средство, одобренное ФДА, — фомивирсен — представляет собой фосфоротиоатный олигонуклеотид из 21 пары нуклеотидов, комплементарный мРНК сверхранних генов цитомегаловируса человека (Nichols and Boeckh, 2000; Perry and Balfour, 1999). Он предназначен для местного лечения цитомегаловирусного ретинита у больных СПИДом. При выраженном, не поддающемся лечению ретините и угрозе потери зрения еженедельные инъекции фомивирсена в стекловидное тело значительно замедляют развитие заболевания. Побочное действие включает повышение внутриглазного давления и слабое или умеренное воспаление. Оба эффекта преходящи и легко поддаются местному лечению глюкокортикоидами.
Другие антисмысловые нуклеотиды. Некоторые другие антисмысловые олигонуклеотиды, предназначенные для лечения различных гемобластозов и злокачественных новообразований, находятся на ранней стадии клинических испытаний (Cotter, 1999; Yuen and Sikic, 2000). При хроническом миелолейкозе могут помочь антисмысловые олигонуклеотиды, комплементарные мРНК химерного онкогена BCR-ABL7. Другие олигонуклеотиды предназначены для подавления экспрессии гена BCL2, который кодирует белок, препятствующий апоптозу и, возможно, играющий важную роль в развитии лимфопро-лиферативных новообразований. Кроме того, мишенями для генотерапии могут быть мРНК, кодирующие протеинкиназы (Raf-1, протеинкиназу С), факторы транскрипции кроветворных клеток (Муb) и другие белки, участвующие в трансформации клеток (Ras, р53). Первые результаты клинических испытаний показывают, что соответствующие антисмысловые олигонуклеотиды хорошо переносятся и высокоэффективны.
Расщепляющие рибозимы
Некоторые искусственно полученные рибозимы способны избирательно расщеплять определенные последовательности РНК in vitro (James and Gibson, 1998; Kijima et al., 1995). В большинстве экспериментов использовали молоткообразные или шпилькообразные рибозимы; они значительно меньше рибозимов, полученных на основе интронов группы I. Рибозимы можно сконструировать таким образом, что они будут связываться с определенной последовательностью РНК и расщеплять ее, инактивируя тем самым РНК-мишень (рис. 5.4). Этот способ инактивации генов был использован в экспериментах по лечению вирусных инфекций (в том числе ВИЧ-инфекции и гепатита В; Меп-keand Hobom, 1997; Wands etal., 1997) и злокачественных новообразований, вызываемых экспрессией онкогенов (Irie et al., 1997). Расщепляющие рибозимы теоретически имеют два преимущества перед другими способами подавления мРНК: 1) расщепление приводит к прямой и необратимой инактивации РНК-мишени и 2) один рибозим расщепляет много молекул РНК, поэтому относительно небольшое количество рибозима способно подавить экспрессию гена.
Использование рибозимов против ВИЧ. Рибозимы способны расщеплять вирусную РНК на нескольких стадиях жизненного цикла вируса. Теоретически мишенями могут быть геномная РНК вируса на стадии заражения клетки, ранние вирусные мРНК, поздние вирусные мРНК и полноразмерные геномные РНК на стадии образования нуклеокапсида. На первый взгляд, расщепление вирусной РНК при проникновении вируса в клетку — наиболее эффективный метод, однако следует учитывать, что нуклеокапсид защищает вирусную РНК от рибозимов. Поэтому наиболее перспективным методом борьбы с ВИЧ-инфекцией считается расщепление ранних вирусных мРНК. Особенно подходят для этой цели молоткообразные и шпилькообразные рибозимы, поскольку они имеют небольшие размеры, простую вторичную структуру и им легко придать специфичность к РНК-мишени.
В нескольких работах показано, что рибозимы могут подавить репродукцию ВИЧ в культуре клеток при заражении последних очень малым количеством вирусов. В первой работе использовали молоткообразный рибозим, расщепляющий in vitro транскрипты гена gag. В культуре Т-лимфоцитов человека этот рибозим подавлял репродукцию ВИЧ (Sarveret al., 1990). Позже были получены рибозимы, специфичные ко многим консервативным последовательностям генома ВИЧ и подавлявшие (в разной степени) репродукцию ВИЧ в разных клеточных культурах. Более того, некоторые рибозимы в первичной культуре Т-лимфоцитов подавляли репродукцию вирусов различных штаммов, включая штаммы, выделенные от бальных (Poeschla and Wong-Staal, 1994). Сравнение каталитически активных и неактивных форм этих рибозимов показывает, что первые более эффективны против ВИЧ. Значит, подавление вирусной репродукции связано с каталитической активностью, а не только с действием антисмысловой последовательности рибозимов.
Чтобы оценить противовирусную активность рибозимов в условиях, более близких к клиническим, с помощью трансфекции модифицировали лимфоциты из крови человека так, что они начинали синтезировать шпилькообразный рибозим, специфичный к участку U5 генома ВИЧ. Такие клетки были устойчивы к заражению как искусственно полученными клонами ВИЧ, так и штаммами, выделенными от больных (Leavitt et al., 1994). Позже было показано, что макрофагоподобные клетки (полученные из стволовых кроветворных клеток пуповинной крови плода), которые синтезировали шпилькообразный рибозим, специфичный к 5′-концевому участку генома ВИЧ, были устойчивы к заражению вирусом, тропным к макрофагам (Yu et al.,1995). Трансфекция стволовых кроветворных клеток — перспективный путь получения клеток, устойчивых к ВИЧ. Такие стволовые клетки дифференцируются в лимфоциты и макрофаги — клетки, наиболее подверженные ВИЧ-инфекции. Начались клинические испытания безопасности и эффективности этого метода лечения ВИЧ-инфекции (Wong-Staal et al., 1998). Подавление экспрессии онкогенов с помощью рибозимов. Злокачественная трансформация часто обусловлена экспрессией мутантных онкогенов. Способность рибозимов избирательно подавлять экспрессию генов может быть использована для создания противоопухолевых средств. Например, молоткообразные рибозимы снижают степень злокачественности различных опухолевых клеток, содержащих активные гены RAS(Scharovsky et al., 2000) и химерный ген BCR-ABL1, характерный для хронического миелолейкоза (James and Gibson, 1998). В экспериментах in vitro показано, что транскрипт химерного гена BCR-ABL1 длиной 8500 нуклеотидов успешно расщепляется молоткообразным рибозимом, специфичным к месту слияния генов (James et al., 1996). В клеточных линиях, полученных при бластном кризе хронического миелолейкоза, экспрессия рибозима, специфичного к транскрипту химерного гена BCR-ABL1, снижает уровень соответствующей мРН К и белкa p210BCRABLI и подавляет пролиферацию клеток (Shore et al., 1993). Сходные результаты были получены при использовании рибозима той же специфичности, но полученного на основе субъединицы рибонук-леазы Р (Cobaleda and Sanchez-Garcia, 2000).
Инсерционная инактивация гена с помощью интронов группы II. Недавнее исследование показало, что с помощью интронов группы II можно также избирательно инактивировать гены (Guoet al., 2000). Модифицированный интрон группы II обладал избирательностью к двум мишеням, важным для ВИЧ-инфекции, — к гену CCR5, кодирующему рецептор Р-хемокинов, и к ДНК провируса. В человеческих клетках транскрибируемые последовательности обоих генов можно разорвать, встроив в них интрон. Эти данные носят предварительный характер, но тем не менее они открывают возможность нового подхода в генотерапии.
.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.
