Содержание
Холинергическая передача
В холинергической передаче важнейшую роль играют два фермента, отвечающие соответственно за синтез и расщепление ацетилхолина — холинацетилтрансфераза и ацетилхолинэстераза (АХЭ).
Холинацетилтрансфераза
Этот фермент катализирует последнюю реакцию синтеза ацетилхолина — соединение холина с ацетил-КоА (Wu and Hersh, 1994; Parsons et al., 1993). Первичная структура холинацетилтрансферазы была установлена с помощью молекулярного клонирования. Ее иммуногистохимическое определение — ценный метод, позволяющий выявлять тела и отростки холинергических нейронов.
Ацетил-КоА, используемый для синтеза ацетилхолина, образуется либо из пирувата путем его окислительного декарбоксилирования (многостадийной реакции, катализируемой пируватдегидрогеназным комплексом), либо из ацетата. В последнем случае под действием фермента ацетил-КоА-синтетазы ацетат соединяется с АТФ с образованием связанного с ферментом ациладенилата (ацетил-АМФ), и далее в присутствии КоА происходит трансацетилирование и синтез ацетил-КоА.
Как и другие нейрональные белки, холинацетилтрансфераза синтезируется в теле нейрона. Затем она переносится по аксону в окончания. В последних имеется множество митохондрий, в которых образуется ацетил-КоА. Холин захватывается из внеклеточной жидкости путем активного транспорта. Ацетилхолин синтезируется в цитоплазме и затем депонируется в синаптических пузырьках. Существуют ингибиторы холинацетилтрансферазы, в том числе с умеренной активностью. Однако их фармакологический эффект невелик, частично из-за того, что лимитирующей реакцией в синтезе ацетилхолина служит захват холина.
Транспорт холина и ацетилхолина
Захват холина из внеклеточной жидкости осуществляется с помощью двух разных систем — высоко- и низкоаффинной. Высокоаффинная система (константа Михаэлиса 1—5 мкмоль/л) имеется только в холинергических нейронах; ее активность зависит от концентрации Na+ во внеклеточной среде, и она блокируется гемихолинием. Концентрация холина в плазме составляет около 10 мкмоль/л, и поэтому она не ограничивает транспорт холина в нейрон. Большая часть холина, образующегося при гидролизе ацетилхолина под действием АХЭ, захватывается обратно в пресинаптическое окончание. Недавно методом молекулярного клонирования была установлена структура высокоаффинного переносчика холина, выделенного из пресинаптических окончаний. Оказалось, что он отличается от переносчиков других медиаторов, но сходен с Na+-3aвисимым переносчиком глюкозы (Okuda et al., 2000).
Синтезируемый ацетилхолин переносится в синаптические пузырьки. Этот перенос осуществляется системой, в которой используется энергия электрохимического градиента для протонов. Везамикол в микромолярных концентрациях блокирует перенос в пузырьки ацетилхолина. Гены холинацетилтрансферазы и переносчика ацетилхолина располагаются в одном и том же локусе (ген переносчика локализован в 1-м интроне гена холинацетилтрансферазы). Поэтому экспрессия обоих этих генов регулируется одним и тем же промотором (Eiden, 1998). АХЭ. Непременным условием эффективной холинергической передачи в нервно-мышечных и некоторых межнейронных синапсах является быстрая инактивация ацетилхолина. Так, в нервно-мышечном синапсе его удаление должно быть буквально, по словам Дейла, молниеносным — иначе ацетилхолин будет диффундировать и активировать рецепторы соседних мышечных волокон.
С помощью современных биохимических методов удалось установить, что гидролиз ацетилхолина АХЭ в нервно-мышечном синапсе занимает меньше 1 мс. Действие же холина на N-холинорецепторы в этом синапсе в 10_3— 10~5 раз слабее, чем действие ацетилхолина.
АХЭ обнаруживается не только в холинергических синапсах, но и в других структурах холинергических нейронов (дендритах, теле, аксонах). Ее концентрация особенно высока в области постсинаптической мембраны нервно-мышечных синапсов.
В глиальных клетках ЦНС и мантийных глиоцитах в низкой концентрации содержится псевдохолинэстераза (бутирилхолинэстераза, холинэстераза); в центральных и периферических нейронах она почти отсутствует. Псевдохолинэстераза обнаруживается главным образом в печени (где она в основном и образуется) и в плазме. Возможно, она выполняет рудиментарную физиологическую функцию — гидролиз эфиров холина, содержащихся в растительной пище. АХЭ и псевдохолинэстераза различаются по скорости гидролиза ацетилхолина и бутирилхолина и по реакции на избирательные ингибиторы. Почти все фармакологические эффекты ингибиторов АХЭ обусловлены подавлением активности именно этого фермента и, как следствие, накоплением эндогенного ацетилхолина в холинергических синапсах и окружающих тканях. У млекопитающих АХЭ и псевдохолинэстераза кодируются разными генами. Разнообразие строения АХЭ обусловлено альтернативным сплайсингом РНК (Taylor et al., 2000).
Особенности различных холинергических синапсов
Выше мы уже упоминали о том, что между различными холинергическими синапсами существуют значительные отличия, касающиеся строения этих синапсов, распределения АХЭ и холинорецепторов, временных параметров синаптической передачи и т. п. Так, в скелетной мышце нервно-мышечный синапс занимает лишь небольшой участок на мышечном волокне, и эти синапсы расположены довольно далеко друг от друга — на соседних волокнах. Напротив, в верхнем шейном ганглии на несколько кубических миллиметров ткани приходится около 100 000 нейронов, и пресинаптические окончания образуют здесь сложную и густую сеть с постсинаптическими дендритами.
Скелетные мышцы. Раздражение двигательного нерва вызывает выделение ацетилхолина в перфузат, оттекающий от соответствующей мышцы; с другой стороны, введение ацетилхолина непосредственно в снабжающие мышцу артерии приводит к ее сокращению. Минимальное количество ацетилхолина (10~17 моль), способное вызвать типичный потенциал концевой пластинки при микроионофоретической аппликации на область концевой пластинки диафрагмы крысы, равно тому количеству этого медиатора, которое выделяется из одного пресинаптического окончания при раздражении диафрагмального нерва (Kmjevic and Mitchell, 1961).
Соединение ацетилхолина с N-холинорецептором постсинаптической мембраны приводит к немедленному и выраженному повышению проницаемости этой мембраны для катионов. Это обусловлено тем, что активация N-холинорецептора сопровождается открыванием связанного с этим рецептором канала. Время пребывания канала в открытом состоянии составляет около 1 мс, и при этом через канал проходит примерно 50 000 ионов Na+ (Katz and Miledi, 1972). В результате открывания множества таких каналов развивается местный деполяризующий потенциал — потенциал концевой пластинки, который, в свою очередь, запускает потенциал действия. Последний вызывает сокращение мышцы. Подробнее все эти процессы и влияние на них средств, блокирующих нервно-мышечные синапсы, описаны в гл. 9.
После перерезки и дегенерации двигательного соматического нерва либо постганглионарных вегетативных волокон реакции денервированных органов возникают в ответ на значительно меньшие дозы медиатора (и некоторых фармакологических средств). Это явление было названо повышением чувствительности денервированных структур. В скелетной мышце при этом N-холинорецепторы появляются за пределами концевой пластинки — сначала рядом с ней, а затем на всей сарколемме. Эмбриональные мышечные волокна до прорастания в них нервных волокон также чувствительны к ацетилхолину на всей своей поверхности. Таким образом, иннервация мышцы приводит к подавлению экспрессии гена N-холинорецептора в ядрах, лежащих в отдалении от синапсов, и, напротив, к повышению экспрессии этого гена (и генов, кодирующих другие синаптические белки) в субсинаптических ядрах (Sanes and Lichtman, 1999).
Внутренние органы. Передача стимулирующих или тормозных сигналов от вегетативных нервов к внутренним органам обусловлена активацией М-холинорецепторов (см. ниже). Эти рецепторы, в отличие от N-холинорецепторов, связаны не с ионными каналами, а с G-белками. В отличие от скелетных мышц и нейронов, у гладких мышц и структур проводящей системы сердца (синусового узла, предсердных пучков, АВ-узла, пучка Гиса с его ножками и волокон Пуркинье) имеется собственная — автоматическая — электрическая и механическая активность. Эта активность не запускается, а лишь модулируется нервными воздействиями. В отсутствие последних в гладкомышечных клетках возникают волны деполяризации и — иногда — потенциалы действия; и те, и другие передаются от клетки к клетке, но значительно медленнее, чем распространяются импульсы по аксонам или волокнам скелетных мышц. Потенциалы действия в гладких и сердечной мышцах возникают в результате ритмичных колебаний мембранного потенциала — спонтанной деполяризации. В гладких мышцах ЖКТ область зарождения возбуждения (ведущий водитель ритма, или пейсмекер) постоянно смещается. В сердце же этой областью в норме всегда является синусовый узел; если же его активность подавляется, то функцию ведущего водителя ритма берут на себя другие структуры проводящей системы.
Аппликация ацетилхолина (в концентрации 0,1—1 мкмоль/л) на изолированные гладкие мышцы кишечника вызывает снижение мембранного потенциала (то есть он становится менее отрицательным) и повышение частоты потенциалов действия; тонус мышц при этом возрастает. Очевидно, это действие ацетилхолина, опосредованное активацией М-холинорецепторов, обусловлено повышением натриевой и, иногда, кальциевой проницаемости. Кроме того, в кальцийсодержащем растворе ацетидхолин может вызвать сокращения некоторых гладких мышц, полностью деполяризованных в результате повышения внеклеточной концентрации К+. Таким образом, ацетилхолин повышает трансмембранные ионные потоки и вызывает выход в цитоплазму кальция из внутриклеточных депо.
В структурах проводящей системы сердца (в частности, в синусовом узле) раздражение холинергических нервов или прямая аппликация ацетилхолина вызывает снижение частоты потенциалов действия, обусловленное гиперполяризацией и замедлением скорости спонтанной деполяризации. Эти эффекты частично обусловлены избирательным повышением калиевой проницаемости (Hille, 1992).
Вегетативные ганглии. Механизмы холинергической передачи в вегетативных ганглиях в основном такие же, как в скелетных мышцах. Потенциалы действия в постганглионарных волокнах можно вызвать введением в ганглий очень небольших количеств ацетилхолина. ВПСП в постганглионарных нейронах возникает в результате активации N-холинорецепторов, непосредственно связанных с ионными каналами (как и в скелетных мышцах). Некоторые другие медиаторы, или так называемые нейромодумторы, снижают либо повышают чувствительность постганглионарных нейронов к ацетилхолину — видимо, меняя мембранный потенциал тел или дендритов этих нейронов. Подробнее передача возбуждения в вегетативных ганглиях рассматривается в гл. 9.
Действие ацетилхолина на пресинаптические рецепторы
Большое количество работ было посвящено возможной роли пресинаптических холинорецепторов в холинергической и нехолинергической передаче и действии ряда лекарственных средств. На симпатических сосудосуживающих нервах, видимо, присутствуют пресинаптические М-холинорецепторы (Steinsland et al., 1973). Их активация сопровождается снижением выброса норадреналина в ответ на нервные импульсы. Физиологическая роль этих рецепторов не ясна, ведь холинергическая иннервация сосудов выражена слабо, а поскольку ацетилхолин быстро гидролизуется тканевыми и плазменными эстеразами, маловероятно, чтобы он, подобно адреналину, играл роль гормона.
Введение эфиров холина приводит к расширению сосудов. Точек приложения у этих веществ несколько; к ним относятся холинорецепторы тормозных синапсов на пресинаптических симпатических окончаниях и холинорецепторы на сосудах, расположенные вне синапсов. Сосудорасширяющее действие ацетилхолина возможно только при неповрежденном эндотелии. Активация М-холинорецепторов эндотелия приводит к выделению из него N0 (эндотелиального фактора расслабления сосудов). Диффундируя от эндотелия к гладким мышцам, N0 вызывает их расслабление, а следовательно, расширение сосудов (Furchgott, 1999).
Холинорецепторы
Сэр Генри Дейл впервые показал, что различные эфиры холина могут оказывать эффекты, сходные с таковыми либо никотина, либо мускарина (Dale, 1914). Было также обнаружено, что последствия раздражения парасимпатических нервов воспроизводятся мускарином. Это позволило Дейлу предположить, что медиатором вегетативной нервной системы служит ацетилхолин либо какой-либо другой эфир холина. Кроме того, отметив двоякое действие ацетилхолина, он ввел термины никотиноподобный и мускариноподобный для обозначения соответствующих эффектов.
Дальнейшие доказательства наличия двух типов холинорецепторов были получены в опытах с применением тубокурарина и атропина. Оказалось, что эти вещества блокируют соответственно никотиноподобный и мускариноподобный эффекты ацетилхолина. Дейл имел дело лишь с неочищенными алкалоидами Amanita muscaria и Nicotiana tabacum, структуры которых в то время были не известны, однако его классификация холинорецепторов действительна и по сей день — хотя и дополнилась представлениями о нескольких подтипах N- и М-холинорецепторов.
Ацетилхолин и некоторые другие вещества активируют оба типа холинорецепторов; другие же стимуляторы и блокаторы действуют избирательно на один из них. Молекула ацетилхолина способна легко деформироваться; по непрямым данным, при связывании с N- и М-холинорецепторами ее конформация различна.
N-холинорецепторы непосредственно связаны с ионными каналами. Активация этих рецепторов всегда вызывает кратковременное (около 1 мс) открывание соответствующих каналов, повышение натриевой и кальциевой проницаемости и деполяризацию — ВПСП или потенциал концевой пластинки. Что же касается М-холинорецепторов, то они принадлежат к суперсемейству рецепторов, сопряженных с G-белками. Реакции на активацию М-холинорецепторов гораздо медленнее, они могут быть как стимуляторными, так и тормозными и не обязательно связаны с изменениями ионных проницаемостей.
Первичная структура различных подтипов N-холинорецепторов (Numa et al., 1983; Changeux and Edelstein, 1998) и М-холинорецепторов (Bonner, 1989; Caulfield and Birdsall, 1998) была установлена на основании данных о строении соответствующих генов. Оказалось, что эти два типа холинорецепторов принадлежат к белкам разных семейств — что не удивительно, учитывая различия в их фармакологических свойствах и функции.
N-холинорецепторы — это пентамеры, состоящие из гомологичных субъединиц. Существуют несколько типов таких субъединиц. В состав каждого пентамерного N-холинорецептора могут входить субъединицы разных типов — но не более 4 типов, так как а-субъединиц обязательно должно быть две. Участки связывания ацетилхолина образуются в местах стыков а-субъединиц с соседними субъединицами. Стенки ионного канала образованы трансмембранными а-спиральными структурами субъединиц (Changeux and Edelstein, 1998; см. также гл. 9 и 12). Структура и свойства М-холинорецепторов описаны в гл. 2 и 7.
Подтипы N-холинорецепторов
Уже давно было известно, что многие стимуляторы и блокаторы действуют только на N-холинорецепторы либо скелетных мышц, либо вегетативных ганглиев — а значит, эти рецепторы различаются. Эти различия были подтверждены и с помощью молекулярного клонирования. Оказалось, например, что N-холинорецепторы скелетных мышц включают субъединицы 4 типов. Структура этих рецепторов соответствует формуле а2р8у или а2рбе: у рецепторов эмбриональных или денервированных мышц имеется субъединица у, у нормальных мышц взрослого — е. Замена субъединицы у на субъединицу I сопровождается некоторым изменением избирательности рецептора к лиганду, но важнее, видимо, то, что такая замена может влиять на скорость обновления рецепторов или их локализацию в клетке. Нейрональные N-холинорецепторы также представляют собой пентамеры. Субъединицы нейрональных N-холинорецепторов очень разнообразны. Они подразделяются на типы а и β; в свою очередь, тип а в нервной системе млекопитающих включает 8 подтипов (а2—а9), а тип β — 3 подтипа (β2—β4)- Не все
сочетания этих субъединиц образуют функционирующие рецепторы, но тем не менее число вариантов таких рецепторов слишком велико для того, чтобы различать их на основании сродства к лигандам. В частности, функционирующими рецепторами служат гомоолигомерные пентамеры субъединиц а7, а8 и а9. Особенности N-холинорецепторов скелетных мышц, периферических вегетативных и центральных нейронов приведены в табл. 6.2. Подробнее структура, функция, распределение и подтипы N-холинорецепторов рассматриваются в гл. 9.
Подтипы М-холинорецепторов
С помощью молекулярного клонирования были выделены 5 подтипов М-холинорецепторов. Как и подтипы N-холинорецепторов, они различаются по локализации и фармакологическим свойствам. Все М-холинорецепторы сопряжены с G-белками (см. ниже и табл. 6.2).
В течение нескольких десятилетий исследовались многие М-холиноблокаторы, но только полученный в 1970-х гг. пирензепин обладал способностью подавлять желудочную секрецию соляной кислоты в концентрациях, не оказывающих иных эффектов. Эти данные, исследование эффектов других стимуляторов и блокаторов, а затем клонирование кДНК М-холинорецепторов привели к разделению этих рецепторов на 5 подтипов, обозначаемых M1—М5 (Bonner, 1989).
Холинорецепторы подтипа М, обнаруживаются в вегетативных ганглиях и некоторых железах, М2 — в миокарде и, возможно, в гладких мышцах, М3 и М4 — в гладких мышцах и железах. В ЦНС имеются рецепторы всех 5 подтипов. Во многих тканях содержатся одновременно рецепторы нескольких подтипов. То же касается и интрамуральных парасимпатических ганглиев.
Как уже говорилось, М-холинорецепторы сопряжены с G-белками, и поэтому их стимуляция приводит к изменению активности ряда внутриклеточных белков. Соединение лигандов с рецепторами подтипов М]( М3 и М5 приводит к активации белков Gq и G11. Это, в свою очередь, вызывает повышение активности фосфолипазы С, гидролизу мембранных фосфолипидов — фосфатидилинозитолполифосфатов — и образованию инозитолполифосфатов. Некоторые из последних — главным образом ИФ3 — вызывают выход Са2+ из эндоплазматического ретикулума. Таким образом, активация рецепторов этих подтипов отвечает за такие кальцийзависимые процессы, как сокращение гладких мышц и секреция (Berridge, 1993; см. также гл. 2). Второй продукт гидролиза фосфатидилинозитолполифосфатов — ДАГ — в присутствии Са + активирует протеинки-назу С. Этот механизм отвечает за модуляцию клеточных функций (в том числе запускаемых ИФ3) и за отсроченные реакции на ацетилхолин (Dempsey et al., 2000).
Рецепторы подтипов М2 и М4 сопряжены с белками Gj и G11. Их активация приводит к ингибированию аденилатциклазы, открыванию калиевых каналов (в частности, в сердце) и в некоторых клетках к снижению вероятности открывания медленных кальциевых каналов. Функциональные последствия этих эффектов наиболее изучены на сердце: именно ингибирование аденилатциклазы и открывание калиевых каналов, видимо, ответственны за отрицательные хронотропный и инотропный эффекты ацетилхолина.
Активация М-холинорецепторов может приводить и к другим событиям, в частности активации гуанилатциклазы и образованию арахидоновой кислоты. Обычно эти процессы вторичны по отношению к иным внутриклеточным реакциям.
.
Редактор: профессор А.Г. Гилман Изд.: Практика, 2006 год.
