молекулярные мишени Молекулярное действие лекарств

МОЛЕКУЛЯРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛЕКАРСТВ

Мишень — это молекула с центром связывания для лекарства. Эта молекула может содержать мембранные белки, распознающие гормоны или нейротрансмиттеры (рецепторы), а также ионные каналы, нуклеиновые кислоты, молекулы-переносчики или ферменты. Но не все лекарства действуют на рецепторы.

Большинство лекарств должны связаться с молекулярной мишенью, чтобы произвести эффект, но существуют и исключения. Уже в первых исследованиях эффектов лекарств на тканях животных в конце XIX в. стало ясно, что большинство лекарств реализуют специфическое действие в определенных тканях, т.е.:

• лекарство, которое оказывает эффект на один тип ткани, может не влиять на другой;
• лекарство может оказывать совершенно разные эффекты на разные ткани.

Например, алкалоид пилокарпин, как и нейротрансмиттер ацетилхолин, вызывает сокращение гладких мышц кишечника и тормозит частоту сердечных сокращений. С учетом этих феноменов Сэмуэль Лэнгли (1852-1925) в 1878 г., основываясь на изучении эффектов алкалоидов пилокарпина и атропина на слюноотделение, предположил, что «существуют некие рецепторные вещества… с которыми оба могут образовывать соединения». Позже, в 1905 г., изучая действие никотина и кураре на скелетные мышцы, он обнаружил, что никотин вызывает сокращения, когда действует на определенные небольшие участки мышц. Лэнгли заключил, что «рецепторная субстанция» для никотина находится в этих участках и что кураре действует путем блокады взаимодействия никотина с рецептором.

Считается, что Пауль Эрлих (1854-1915) самостоятельно разработал теорию рецепторов, наблюдая, как многие органические красители селективно окрашивают специфические компоненты клетки. В 1885 г. он предположил, что у клеток есть «боковые цепи», или «рецепторы», к которым лекарства или токсины могут присоединяться, реализуя свое действие. До сих пор Эрлих известен благодаря своей идее о «волшебной пуле» — химическом соединении, образованном для выявления селективной токсичности, например, инфекционного агента. Кроме того, Эрлих синтезировал органические производные мышьяка, которые использовали ранее при лечении сифилиса. Развивая теорию рецепторов, Эрлих был первым, кто показал, что быстрая обратимость действия алкалоидов свидетельствует о непрочных (нековалентных) химических связях между лекарством и рецепторами.

Последние достижения молекулярной биологии раскрывают природу связи лекарство-рецептор на молекулярном уровне. Сегодня под рецептором понимают специфическую молекулярную структуру, которая работает как молекулярная мишень для группы соответствующих лекарств (раньше связывающий центр не был определен отдельно от молекулярной мишени, и весь комплекс в целом рассматривали как рецептор).

Не все лекарства имеют молекулярные мишени

Для лекарств, действующих на ферменты, молекулярной мишенью является фермент. Рецептором выступает та часть фермента, которая связывается с лекарством. Для большинства лекарств молекулярными мишенями являются белки, углеводы, липиды и другие макромолекулы, на которые направлено действие препаратов. С этой позиции молекулярные мишени определены более точно, чем другие рецепторы.

Сегодня рецепторы определены и охарактеризованы с помощью методов молекулярной биологии. Действие некоторых типов лекарств легко объяснить без вовлечения молекулярных мишеней человека. К этим типам лекарств относятся антациды (буферы), которые уменьшают кислотность в желудке, формообразующие слабительные и комплексообразователи. Есть вещества, для механизма действия которых характерно отсутствие четкой химической специфичности. Основным примером являются газообразные и летучие общие анестетики, включая инертный газ ксенон. Для этих препаратов практически невозможно определить связывающий центр или одну молекулярную мишень. Тем не менее, вероятно, их фармакологические эффекты происходят из-за действия на компонент мембран (например, потенциал- или лиганд-зависимые ионные каналы). Этот компонент и является молекулярной мишенью для анестетиков.

Теория рецепторов очень важна для средств, которые действуют сходно или антагонистически гормонам, нейрогормонам, нейротрансмиттерам и аутакоидам

Лекарства (включая такие растительные алкалоиды, как никотин, кураре и атропин), которые оказывают сходные или противоположные нейротрансмиттерам эффекты, привели Лэнгли к формулировке теории рецепторов. Изучение действия этих средств первоначально сводилось к оценке их эффектов у животных и на изолированных тканях: например, на артериальное давление, частоту сердечных сокращений, секрецию или, чаще, сокращения гладких мышц кишечника, бронхов, сосудов или матки. Эти эффекты давно расценивают как побочную реакцию на взаимодействие лекарств с их рецепторами. Теория рецепторов способствовала развитию подходов, использующих эти данные для классификации лекарств по рецепторам, с которыми они взаимодействуют, и разработке новых лекарств, нацеленных на специфические рецепторы.

Классические рецепторы нейротрансмиттеров или гормонов в основном представлены крупными белками, содержащими участки, которые «распознаются» лекарствами и связываются с ними (рис. 2.1). Эти связывающие центры обычно ассоциированы с системой переноса

Стало ясно, что многие рецепторы являются белками. Они содержат как минимум один отдельный центр, с которым связываются и агонисты, и антагонисты. Когда связывается агонист, он запускает цепь трансдукции, которая либо непосредственно вызывает измеримый ответ (например, открытие канала), либо изменяет активность фермента, что в свою очередь приводит к измеримому ответу. Связь между действием агониста и трансдукцией может быть прямой или вовлекать в действие вторичные мессенджеры и каскад других белков. В общем случае трансдукцию вызывает не распознаваемый участок, а, скорее, происходящие аллостерические изменения рецепторной молекулы, обусловливающие каталитическую активность других частей белка (обычно во внутриклеточной среде). При этом другие части молекулы рецептора могут работать как мишени для других типов лекарств-ингибиторов, которые не являются конкурентными антагонистами.

Активный комплекс агонист-рецептор вызывает клеточный ответ через реакцию трансдукции

Активный комплекс агонист-рецептор инициирует трансдукцию либо локально на уровне мембраны, либо внутриклеточно. Примеры системы трансдукции приведены далее. Общепризнано, что в большинстве случаев ассоциация агониста с рецептором ведет к конформационным изменениям последнего и возникновению активного комплекса лекарство-рецептор. Это дает основу для модели, с помощью которой можно объяснить различное действие агонистов, частичных агонистов и антагонистов.

С рецептором могут связываться различные типы лекарства. Здесь связывание определяет лекарство в качестве лиганда для рецептора, а результат связывания показывает, является ли лекарство агонистом, антагонистом, частичным агонистом или обратным агонистом:

• если лиганд связывается с рецептором и вызывает молекулярный ответ (конформационное изменение рецептора) с последующим клеточным ответом, это агонист;

• если лиганд связывается с рецептором без индукции молекулярного ответа, ведущего к клеточному и тканевому ответу, и конкурентно блокирует доступ агониста к рецептору, этот лиганд рассматривают как конкурентный антагонист;

• если лиганд связывается с рецептором таким образом, что даже высокие концентрации не могут вызвать достаточный молекулярный ответ, лиганд называют частичным агонистом. Следовательно, максимальный тканевый ответ на действие частичного агониста будет меньше, чем на действие «полного» агониста;

• если лиганд связывается с рецептором, который в отсутствие агониста находится в активном состоянии, и делает этот рецептор неактивным, этот лиганд — обратный агонист.

Базальный уровень активности вызывает фоновый уровень трансдукции и клеточных эффектов. Когда обратный агонист связывается с активным рецептором, он инактивирует его и тем самым ингибирует базальную активность.

Тканевые ответы не обязательно прямо пропорциональны клеточным ответам, возникающим от связывания агониста с его рецептором (см. далее)

Лекарства и эндогенные вещества (гормоны и нейротрансмиттеры), которые активируют рецепторы, называют агонистами. Молекулярный ответ обусловлен активированным состоянием рецептора, который инициирует клеточный ответ.

Эндогенные агонисты есть ко многим рецепторам. Иногда эти агонисты называют первичными мессенджерами, поскольку взаимодействие с их молекулярной мишенью является первым проявлением внутриклеточных связей (аналогично другие молекулы, участвующие в развитии клеточного ответа, известны как вторичные мессенджеры).

Агонист, который полностью активирует рецептор, называют полным агонистом (см. далее в описании частичного агонизма).

В отсутствие агониста большинство рецепторов пребывают в состоянии покоя. Однако даже в этом случае рецептор может временно становиться активным, что приводит к низкоуровневому молекулярному ответу. Появление агониста изменяет равновесие в сторону активированного состояния.

Математическое соотношение между концентрацией агониста (А) и ответом определяется связыванием с рецептором (R) и ответом в результате формирования комплекса агонист-рецептор (AR), который активирует рецептор (R*). Поэтому А + R = AR =AR*. Для активации некоторых рецепторов необходима связь двух молекул агониста (А + А + R= AAR= AAR*). Для других рецепторов характерна реакция А + R + R = ARR = ARR*, т.е. присоединение агониста ведет к связыванию двух неактивных рецепторов в активированный гомодимер. Математическая основа для такого соотношения детально обсуждается далее. В книге агонисты указаны специальным значком (рис. 2.2).

В большинстве клеток максимальный клеточный ответ на действие агониста происходит только тогда, когда активирована небольшая часть рецепторов. Другими словами, рецепторов обычно намного больше, чем необходимо для достижения максимального клеточного ответа. Этот избыток рецепторов (резервные рецепторы) очень важен, поскольку он увеличивает чувствительность клетки к малым изменениям концентрации агониста (см. далее).

Частичный агонизм — это неэффективная активация рецептора

Лекарство, которое относительно неэффективно активирует рецептор, является частичным агонистом. Частичный агонист — это средство, взаимодействие которого с рецептором оказывает эффект меньше максимального либо вызывает или не вызывает молекулярный ответ (недостаточный молекулярный ответ). В любом случае максимальный клеточный ответ на действие частичного агониста меньше, чем максимальный клеточный ответ на действие полного агониста, действующего на тот же рецептор без вовлечения резервных рецепторов. Для частичных агонистов необходимо взаимодействие с большим количеством рецепторов для возникновения максимального клеточного ответа, когда нет неоккупированных рецепторов или остается их небольшое количество. Если присутствует множество резервных рецепторов, возможно, что частичный агонист вызывает максимальный клеточный ответ, хотя считается, что частичный агонист менее эффективен, чем полный, и требует большей оккупации рецепторов для возникновения максимального клеточного ответа (см. далее). Большинство клеток содержат намного больше рецепторов, необходимых для возникновения максимального клеточного ответа, поэтому частичные агонисты чаще всего способны вызвать максимальный клеточный ответ, сходный с действием полных агонистов, но для этого необходимы очень высокие дозы препаратов.

Обратный агонизм — это инициация явного клеточного ответа путем торможения спонтанной активации рецептора

Молекулярный ответ на обратный агонизм может быть:

• инактивацией активированного рецептора;
• стабилизацией рецептора в неактивной конформации.

Данная модель выглядит как R = R* и I + R* = IR, где R* — активированное состояние, I — обратный агонист.

Антагонизм — это предотвращение действия агониста

Многие лекарства связываются с рецептором, образуя комплекс лекарство-рецептор, который не вызывает клеточного ответа. Более того, оккупация рецептора антагонистом препятствует либо связыванию агониста, либо возникновению клеточного ответа при связывании агониста с рецептором. Таким образом, антагонизм может быть результатом различных молекулярных механизмов. Математическое описание эффектов различных типов антагонистов приведено далее. Кратко — антагонизм может возникать вследствие:

• связывания антагониста в том же участке рецептора, который в норме занимает агонист. Связывание антагониста препятствует оккупации центра агонистом (конкурентный антагонизм);

• связывания антагониста с участком рецептора, который в норме не оккупирует агонист (аллостерический центр), ведущего к конформационным изменениям связывающего центра агониста, что либо препятствует связыванию агониста, либо делает невозможным возникновение молекулярного ответа.

Антагонист, связывающийся с аллостерическим центром только в отсутствие агониста, называют неконкурентоспособным антагонистом. Если антагонист может связываться с аллостерическим центром даже в присутствии связанного агониста, его называют неконкурентным антагонистом. В данном случае центр часто называют лиганд-связывающим (где лигандом может быть агонист, антагонист, частичный агонист и др.).

Таблица 2.2 Шесть возможных типов антагонизма

Связывание антагониста может быть обратимым или необратимым. Различают как минимум шесть возможных типов антагонизма (табл. 2.2). Эффекты, проявляемые антагонистом в ответ на действие агониста, детально описаны далее. Для обозначения антагонистов будет использоваться значок, указанный на рис. 2.3.

Физиологический антагонизм отличается от фармакологического антагонизма

Часто термин «физиологический (или функциональный) антагонизм» используют некорректно. Этот термин описывает способность агониста (чаще, чем антагониста) тормозить ответ на другой агонист путем активации разных, физически разделенных рецепторов. Это может происходить, если рецепторы двух агонистов объединены одинаковыми компонентами клеточного ответа, но по-разному действуют на них, или связаны разными компонентами клеточного ответа, которые вызывают противоположные тканевые ответы. Наглядным примером служит взаимодействие между норадреналином и ацетилхолином в артериолах. Норадреналин вызывает сокращение, а ацетилхолин — расслабление. Конечно, бессмысленно описывать норадреналин как антагонист ацетилхолина, поскольку также можно ацетилхолин расценивать как антагонист к норадреналину, поэтому термины «агонист» и «антагонист» становятся взаимозаменяемы и не имеют смысла. Термин «антагонист» лучше всего подходит для описания лекарств, которые тормозят молекулярный ответ на действие агониста. Термин «функциональный антагонист» лучше не использовать.

Количественный анализ механизмов действия лекарств в основном заключается в интерпретации кривых доза-ответ

Количественный анализ действия лекарств важен при разработке новых препаратов, если цель состоит в получении:

• препаратов, селективных по рецепторам, с которыми они взаимодействуют;
• препаратов, селективных по особенности их взаимодействия только с одним подтипом рецептора.

Существует несколько фундаментальных принципов при оценке кривых связывания лекарства с рецептором и доза-ответ. К большинству препаратов, используемых в клинической практике и в эксперименте, могут быть применимы следующие принципы:

• на любой клетке в ткани находятся рецепторы; большинство клеток экспрессируют множество разных типов рецепторов;

• в присутствии препарата постоянно случайным образом создаются комплексы лекарство-рецептор благодаря столкновению движущихся молекул лекарства с неоккупированными рецепторами. Комплексы лекарство-рецептор постоянно разрушаются, освобождая таким образом рецепторы для повторного взаимодействия с лекарством;

• комплексы рецептор-агонист постоянно меняются от неактивной конформации к активной (молекулярный ответ). Последняя вызывает биофизические изменения, например открытие ионных каналов, или биохимические изменения, например активацию G-белков, что ведет к тканевому ответу;

• число рецепторов на клетке может изменяться при патологических процессах или длительном приеме лекарств.

К этим фундаментальным принципам можно добавить два полезных правила:

• субмаксимальный тканевый ответ на агонист пропорционален дозе (концентрации) агониста и числу доступных рецепторов;
• связываясь с рецепторами, антагонист уменьшает число рецепторов, доступных агонисту, независимо от дозы агониста.

Перечисленные ранее фундаментальные принципы отражают действие лекарств с точки зрения связи между эмпирическими наблюдениями и экспериментальными данными и основными химическими и физико-химическими реакциями. Количественные параметры этой теории в различных аспектах проявляются при связывании радиоактивно меченных лигандов с рецепторами в культуре ткани. Поскольку подобные эксперименты легко воспроизводимы и понятны, удобнее рассматривать связывание лекарства с рецептором до изучения кривых доза-ответ.

Связывание лекарства с рецептором

Рецептор можно рассматривать как структуру, которая селективно и специфически связывает лекарство. Для упрощения приведем пример селективного связывания лекарства только с одним определенным центром рецептора.

Самая простая модель обратимого связывания лекарства

Согласно самой простой модели обратимого связывания лекарства с рецептором, каждая молекула лекарства (D) может случайно присоединяться к молекуле рецептора (R), формируя комплекс лекарство-рецептор (DR). Этот комплекс впоследствии разрушается, высвобождая молекулу лекарства и неоккупированный рецептор. Согласно закону действия масс, скорость формирования новых DR-комплексов пропорциональна концентрации D и концентрации свободных R, т.е. [D] и [R] соответственно (концентрацию обозначают в квадратных скобках). В то же время скорость, с которой DR-комплексы разрушаются до D и R, пропорциональна концентрации DR, т.е. [DR].

В состоянии равновесия скорость образования DR-комплексов равна интенсивности их разрушения, т.е.:

KD [DR] = [D] [R], (ф. 2.1)

где KD — константа диссоциации, обычно выражаемая в молях (М). KD зависит от физических факторов, таких как температура, и химической природы взаимодействующих веществ. В данной простой модели KD представляет собой соотношение присоединения и отсоединения. Важно отметить, что сходное уравнение применимо к более сложным моделям, в которых присутствуют сложные конформации R и DR, в комплексных случаях KD зависит от значения всех постоянных, необходимых для описания системы. Тем не менее независимо от количества конформаций R и DR рецептор может рассматриваться только в двух формах — R и DR с KD [DR] = [D] [R]. Другая форма уравнения выглядит как [DR] = [D] [R]/KD.

[DR] + [R] является постоянной

Общее количество рецепторов ограничено, поэтому конечная концентрация [DR] + [R] постоянна. Ее обозначают [RJ. Следовательно:

если [DR] заменить на [R] [D]/Kd (см. ранее).

Объединение этого уравнения с KD [DR] = [D] [R] дает:

при [DR]/[Rt], указывающее, что только один R в данный момент объединен с D.

Полулогарифмические графики обычно используют и для кривых концентрация-ответ, и для изучения связывания

График [DR] против [D] для двух лекарств (А и В с очень разными значениями KD) приведен на рис. 2.4. На нем видно, что хотя оба графика характеризуются одинаковым начальным линейным подъемом по концентрации, который к максимуму уплощается, неудобно использовать одну и ту же ось X для обоих лекарств. На рис. 2.5 те же данные представлены как полулогарифмические, т.е. [DR] против log[D]. Графики показывают, что обе кривые в целом одинаковы и различаются только в положении относительно оси X. Такие полулогарифмические кривые используют для изучения связывания и зависимости доза-ответ.

При изучении связывания рецепторы инкубируют при различных концентрациях D, когда D мечен радиоактивным изотопом (обычно 3Н), затем их быстро фильтруют и промывают для удаления несвязанного лекарства. Последующий подсчет остаточной радиоактивности показывает, сколько лекарства осталось. Однако некоторая оставшаяся часть обусловлена простой неспецифической задержкой лекарства в порах фильтра либо между клетками или, вероятно, растворением в липидах ткани. Эффект неспецифического связывания выражается в процентах от специфического.

Описание к рис. 2.4 Линейный график специфического и неспецифического рецепторного связывания двух препаратов, А и В, где KD = 0,01 мкМ (КА) и KD = 0,1 мкМ (Кв). По оси Y: связывание (образование AR или BR), выраженное в процентах от максимального специфического связывания А и В соответственно. По оси X: концентрации А и В. Примечание: шаг на оси концентраций равный (линейный), пересечение соответствует 0,0. мкМ — микромо-лярная концентрация.

Описание к рис. 2.5 Полулогарифмический график рис. 2.4. Связывание при более высоких концентрациях А и В было изучено в таких же условиях, как на рис. 2.4, где КА = 0,01 мкМ и Кв = 0,1 мкМ. На данном рисунке ось X отображена logI0 в пределах концентраций от 10~10 до > 10-5 М, что является снижением концентрации в 100 000 раз. Пересечение осей X и Y находится в 0, -10. Аффинитет — это способность препарата связываться со своим рецептором, которую измеряют через KD. Кривизна кривой связывания показывает природу связывания. Эта простая модель имеет значение 1, поскольку одна молекула D связывается с одной молекулой R. М — молярная концентрация.

Исследования связывания дают ценную информацию о взаимодействиях между лекарством и рецептором

• свободный R с концентрацией [R];
• DR с концентрацией [DR] = [R] [D]/Kd;
• IR с концентрацией [IR] = [R] [I]/Kj (где — константа диссоциации IR). Из указанного можно вывести следующее уравнение:

где [Rt] — сумма всех форм R. Сходные уравнения могут быть получены для [DR] и [IR]. Далее серия уравнений может быть выведена путем замещения.

Описание к рис. 2.7 Специфическое связывание препарата (L) в присутствии конкурентного антагониста (I) при различных концентрациях [l]/K| = 1, 10, 100 или 1000. Как и на рис. 2.5, это полулогарифмический график, на котором ось X выражена в 1од10. Примечание: присутствие I сдвигает кривую концентрация-связывание для L вправо параллельно. Величина сдвига зависит от [1]/К|, при которой каждое 10-кратное увеличение вызывает параллельный сдвиг на log 1,0 (= 10). Кi- константа диссоциации I; М — молярная концентрация.

На этом построен метод экспериментального определения константы диссоциации конкурирующей молекулы. При любой [I] отношение доз (dose ratio) (DR), равное значениям [D], формирующим такую же [DR] в присутствии или в отсутствии С, рассчитывают как:

DR = 1 + [I]/Ki (ф. 2.5)

Преобразовав это уравнение, получаем:

(DR — 1)/[I] =1/Кi (ф. 2.6)

Данный метод менее важен при исследовании связывания, но представляет большой интерес при оценке зависимости функциональная концентрация-ответ при взаимодействии агониста/антагониста с рецептором, когда ответ на [DR] измерен точнее, чем связывание. Добавление конкурентного антагониста I в присутствии агониста D эквивале

Видео по теме