Нингидриновая реакция на определение аминокислот и белка

Спектрофотометрическое исследование продуктов нингидриновой реакции

Разработка точных, доступных методов анализа а-аминокислот является одной из актуальных задач современной фармации, в данной статье описан простой и доступный способ определения аминокислот и протеина в различных продуктах, включая биологически-активные добавки и спортивное питание.

В настоящее время существует ряд методов количественного определения а-аминокислот в лекарственном растительном сырье, в лекарственных препаратах и биологических жидкостях [1—31]. Однако, несмотря на высокую точность, их применение ограничено длительностью приготовления рабочих растворов (потенциометрическое титрование в неводной среде), дороговизной оборудования (ГЖХ, ВЭЖХ) [4, 6,27,28, 30].

Для анализа а-аминокислот также широко используют методы, основанные на реакции с нингидрином [1,3, 8,9, 11-20,23, 29].

Khan А. с соавторами изучили механизм нингидриновой реакции [29]:

На первой стадии реакции о-аминокислот с нингидрином (I) образуются углерода диоксид, альдегид и устойчивое промежуточное соединение — 2-аминоиндандион (II), участвующий в двух параллельных реакциях. В одной из них он реагирует с нингидрином до образования 2-гидроксииндандиона (III) и 2-иминоиндандиона (IV), которые, конденсируясь между собой, формируют дикетогидринденкетогидринамин (V). Во второй реакции 2-аминоиндандион в кислой среде подвергается гидролизу до аммиака и 2-гидроксииндандиона, последний, взаимодействуя с нингидрином, образует гидриндантин (VI).

Установлено, что характерная для большинства а-аминокислот пурпурная окраска(окраска Румана) обусловлена образованием дикетогидринденкетогидринамина (V), а также продукта параллельной реакции — гидриндантина (VI), который мало растворим в воде и растворим в органических растворителях — диметилсульфоксиде (ДМСО) и метилцелозольве. Поэтому, с целью повышения чувствительности реакции, по предположению авторов, наиболее рационально использовать растворы нингидрина в указанных растворителях. Максимальные значения оптической плотности продуктов реакции (при длине волны 575 нм) наблюдаются при соблюдении следующих условий ее проведения: температура реакционной смеси — 95 °С, pH — 5-6. Кроме того, реакцию необходимо проводить без доступа кислорода, в атмосфере азота.

Для детектирования продукта нингидриновой реакции используют спектрофотометры, флуориметры.

Широкое распространение в анализе аминокислот получили аминокислотные анализаторы [1,9,11,13—15, 17]. Данный метод основан на разделении аминокислот с помощью ионообменной хроматографии с последующим фотоколориметрическим определением продуктов реакции аминокислот с нингидрином. Применение аминокислотных анализаторов позволяет разделить исследуемый образец на отдельные компоненты и определить их количество быстро и с высокой точностью. Главным недостатком данного метода анализа является высокая стоимость оборудования, что делает его недоступным для большинства лабораторий.

Более доступными и простыми являются фотоколориметрические и спектрофотометрические методы анализа о-аминокислот, основанные на их взаимодействии с нингидрином. Так, В.А. Храмовым модифицирован метод определения диаминокислот по Чинарду [12]. Метод основан на образовании красно-коричневых продуктов взаимодействия диаминокислот с нингидрином с последующим фотоколориметрическим определением при длине волны 490 нм. Метод является специфичным: нейтральные аминокислоты, а также амины и диамины при pH 1 с нингидрином окрашенных продуктов не образуют. Несмотря на доступность и простоту данный метод не является универсальным для всех а-аминокислот и позволяет определить лишь диаминокислоты, из которых наибольшее практическое значение имеет незаменимая аминокислота лизин. Кроме того, этим методом можно определить пролин.

Разработана точная методика количественного определения кислоты аспарагиновой в лекарственном препарате «Аспаркам», основанная на ее взаимодействии с 1 % этаноловым раствором нингидрина и последующим определением оптической плотности продукта реакции при длине волны 568 нм. Метод отличается хорошей воспроизводимостью, относительная ошибка среднего результата составила ±2,25 % [19]. Кроме того, предложен спектрофотометрический метод анализа суммы аминокислот различных видов пыльцы, основанный на взаимодействии с 2 % этаноловым раствором нингидрина [11].

С этих позиций представляет интерес изучение спектральных характеристик продуктов нингидриновой реакции 20-ти наиболее важных в биологическом отношении а-аминокислот, оптимизация условий ее проведения с целью разработки точного и доступного метода количественного определения а-аминокислот в растительном сырье, субстанциях и суммарных лекарственных препаратах.

Исследование спектральных характеристик продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне

В соответствии с ГФ XI наиболее часто в хроматографических методах анализа а-аминокислот используют 0,2 % раствор нингидрина в ацетоне [3, 8]. На этом основании мы изучили спектры продуктов реакции для 20-ти а-аминокислот с ОД % раствором нингидрина в ацетоне с целью создания нового метода количественного анализа аминокислот в различных объектах.

Нингидриновую реакцию проводили по методике, указанной в ФСП на кислоту глутаминовую в разделе «подлинность»: к 1 мл 2 % раствора а-аминокислоты прибавляют 1 мл свежеприготовленного 0,2 % раствора нингидрина в ацетоне и нагревают до появления сине-фиолетовой окраски [10]. Цистеин и тирозин, вследствие их низкой растворимости в воде, использовали в виде менее концентрированных 0,04 % растворов. После полного охлаждения продукты нингидриновой реакции каждой из 20-ти а-аминокислот разбавляли водой в различных соотношениях до получения значений оптической плотности максимумов поглощения от 0,4 до 1,0.

Исследование спектров поглощения в видимой области показало наличие двух максимумов в диапазонах длин волн 399-405 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 19-ти из 20-ти а-аминокислот (рис. 1-4). Исключение составляет пролин, продукт реакции которого с нингидрином имеет один максимум поглощения в видимой области — при длине волны 416 нм, что объясняется отсутствием первичной аминогруппы в структуре данной аминокислоты.

Исследована также УФ-область спектра продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и установлено, что все они также имеют два максимума поглощения в диапазонах длин волн 220-237 и 254-260 нм (рис. 5-8). Исключение составляет продукт реакции с пролином, максимумы поглощения которого составляют 299 и 343 нм.

Максимумы поглощения (в видимой и УФ-области) продуктов взаимодействия 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне представлены в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика спектров поглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне.

Из данных таблицы 1 видно, что для большинства а аминокислот характерны четыре максимума поглощения, два из которых находятся в УФ-области, в интервале длин волн 228-237 и 251-263 нм, и два — в видимой области, в диапазоне 399-402 и 560-568 нм.

Оптимизация условий реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне

Как установлено нами выше, большинство продуктов реакции а-аминокислот с раствором нингидрина в ацетоне характеризуются единым максимумом поглощения при длине волны 400 нм, что обуславливает целесообразность использования данной длины волны в качестве аналитической.

Нами установлено, что продукты реакции, проведенной по методике, указанной в разделе 1.1, характеризуются низкой стабильностью во времени (для большинства а-аминокислот значение оптической плотности в диапазоне длин волн 399-400 нм и интервале 1-2 ч после начала реакции снижается более чем на 15 %). Поэтому нами изучены оптимальные условия реакции в зависимости от соотношения между ее компонентами (навески и объема раствора о-аминокислоты, объема ОД % раствора нингидрина в ацетоне), продолжительности и температурного режима реакции. Для анализа мы использовали фенилаланин.

С целью изучения влияния количественных соотношений между растворами фенилаланина и нингидрина на стабильность продукта реакции нами проведена серия экспериментов (табл. 2). Реакцию проводили при температуре 100 °С в течение 10 мин (до образования темно-фиолетовой окраски). Продукты после полного охлаждения разбавляли водой и измеряли значение оптической плотности при длине волны 400 нм. О стабильности продуктов реакции мы судили по величине снижения оптической плотности, % за период 1-2 ч после начала реакции.

Таблица 2. Оптимизация количественных соотношений компонентов реакции

Здесь и далее — показывает соотношения между объемами продукта реакции до и после их разведения водой (мл).

На основании полученных данных нами установлены оптимальные соотношения между компонентами реакции: 2,5 мл 0,2 % раствора о аминокислоты и 0,5 мл 0,2% свежеприготовленного раствора нингидрина в ацетоне. При соблюдении данных условий образуется наиболее стабильный продукт, характеризующийся максимальным значением оптической плотности при длине волны 400 нм,

Мы изучили также влияние продолжительности реакции во времени на величину и стабильность значения оптической плотности продукта (табл. 3). Реакцию проводили с учетом оптимизированных выше соотношений между ее компонентами при температуре 100 °С.

Таблица 3 Оптимизация продолжительности реакции во времени

Анализ данных таблицы 3 показывает, что наиболее стабильный продукт с максимальным значением оптической плотности образуется при проведении реакции в течение 15 мин. Более длительное нагревание приводит к разложению продуктов реакции со значительным снижением оптической плотности. При нагревании реакционной смеси менее 15 мин величина оптической плотности вначале незначительно возрастает, а затем наблюдается резкое снижение ее значения.

Далее мы изучили влияние температурного режима реакции на стабильность значения оптической плотности продукта при длине волны 400 нм. Реакцию проводили в диапазоне температур от 50 до 110 в течение 15 мин (табл. 4).

Таблица 4 Оптимизация температурного режима реакции

Мы установили, что при температуре ниже 70 °С реакционная смесь характеризуется отсутствием максимумов поглощения в диапазонах длин волн 399-402 и 560-570 нм а также характерной сине-фиолетовой окраски. Наиболее высокие и стабильные значения оптической плотности наблюдаются при проведении реакции с температурным режимом 100 °С (за период 1-2 ч после начала реакции значение оптической плотности при длине волны 400 нм снизилось на 4 %). Проведение реакции выше 100 °С нецелесообразно т.к. образующийся продукт нестабилен во времени.

Таким образом, нами установлены оптимальные условия проведения реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и на этом основании предлагается следующая методика анализа: к 2,5 мл 0,2 % раствора а-аминокислоты добавляют 0,5 мл 0,2 % раствора нингидрина в ацетоне и нагревают при температуре 100 °С в течение 15 мин (для лизина продолжительность реакции составляет 3-5 мин, т.к. более длительное нагревание приводит к разложению продукта реакции). После полного охлаждения продукт реакции разбавляют водой очищенной и спустя 1 ч после начала реакции определяют значение оптической плотности в диапазонах длин волн 399-402 нм на спектрофотометре в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Данные условия проведения реакции мы использовали для большинства а-аминокислот, однако цистеин и тирозин вследствие их низкой растворимости в воде использовали в концентрации 0,04 % растворов по 2,5 мл.

С целью выявления подчинения закону светопоглощения продуктов реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне при длине волны 400 нм нами исследована зависимость светопоглощения от концентрации а-аминокислоты (рис. 9).

На рис. 9 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт взаимодействия метионина с 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне подчиняется закону светопоглощения при длине волны 400 нм в концентрациях от 0,005 до 0,02 мг/мл.

С целью установления аналитических возможностей оптимизированных условий нингидриновой реакции, нами проведен спектральный анализ раствора нингидрина в ацетоне после его нагревания при температуре 100 °С, без добавления раствора а-аминокислоты (табл. 5). Продукт реакции разбавляли водой до 100 мл.

Таблица 5. Спектральный анализ 0,2 % ацетонового раствора нингидрина

Спектральный анализ показал, что раствор нингидрина в ацетоне имеет светопоглощение в тех же диапазонах длин волн, что и продукты его реакции с аминокислотами. Возможно, при нагревании происходит взаимодействие ацетона с нингидрином, и образуются продукты, которые поглощают в УФ- и видимой области спектров. Таким образом, ацетоновый раствор нингидрина может быть использован для количественного определения а-аминокислот только при условии сравнительного анализа спектральных данных продукта реакции анализируемой а-аминокислоты и раствора нингидрина, что существенно усложняет проведение анализа. Кроме того, ацетон является летучим, токсичным и пожароопасным растворителем, что ограничивает его использование.

На этом основании нами изучены продукты нингидриновой реакции в нелетучем растворителе — диметилсульфоксиде (ДМСО).

Исследование реакции а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в диметилсульфоксиде

В следующей серии экспериментов в качестве растворителя для нингидрина мы использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Растворы нингидрина в ДМСО часто используют для количественного определения аминокислот с помощью аминокислотных анализаторов [1]. Важно отметить, что ДМСО имеет преимущества по сравнению с ацетоном: данный растворитель нелетучий, имеет невысокую токсичность, взрыво- и пожаробезопасен, что обеспечивает удобство его использования.

В экспериментах, на основании ранее оптимизированных условий реакции, мы использовали 0,2 % раствор нингидрина в ДМСО.

Нами исследованы спектры поглощения продуктов реакции 20-ти а-аминокислот с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО в диапазонах длин волн 220-600 нм. Реакцию проводили в течение 15 мин при температуре 100 °С по методике, которую мы оптимизировали для проведения реакции с раствором нингидрина в ацетоне (см. раздел 1.2.). После полного охлаждения продукты нингидриновой реакции каждой из 20-ти си-аминокислот разбавляли водой в различных соотношениях до получения значений оптической плотности максимумов поглощения от 0,4 до 1,0. Нами установлены три максимума поглощения при 250, 400 и 560-570 нм. Данная закономерность наблюдается для 18-ти из 20-ти а-аминокислот. Исключение составили продукты нингидриновой реакции с триптофаном и пролином, что объясняется особенностями структуры данных а-аминокислот. Продукт нингидриновой реакции триптофана в УФ-области имеет максимум поглощения при 272 нм, в видимой области спектра максимумы поглощений аналогичны другим а-аминокислотам. Продукт реакции раствора нингидрина в ДМСО с пролином окрашен в жёлтый цвет и имеет два максимума поглощения при длинах волн 300 и 340 нм, в видимой области спектра максимумы поглощения отсутствуют, однако имеется четкое плечо в широком диапазоне длин волн 520-600 нм, с достаточно интенсивным поглощением. Важно отметить, что продукты реакции большинства а-аминокислот имеют единые максимумы поглощения при 250 нм и 400 нм.

По аналогии с ацетоновым раствором нингидрина, нами изучена зависимость светопоглощения продукта реакции с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО от концентрации а-аминокислоты при длине волны 400 нм и установлено её подчинение закону светопоглощения Бугера — Ламберта — Бера (рис. 10).

На рис. 10 приведен калибровочный график, который показывает, что продукт реакции глицина с 0,2 % раствором нингидрина в ДМСО при длине волны 400 нм подчиняется закону светопоглощения в концентрации глицина от 0,03 до 0,19 мг/мл.

Для выяснения аналитических возможностей реакции нами изучены спектральные характеристики 0,2 % раствора нингидрина в ДМСО в условиях ее проведения, где вместо раствора а-аминокислоты добавляли равное количество воды. После полного охлаждения продукт реакции разбавляли водой до 100 мл. (табл. 6).

Таблица 6. Спектральный анализ 0,2 % раствора нингидрина в ДМСО

Спектральный анализ показал, что раствор нингидрина в ДМСО, также как и в ацетоне поглощает в тех же диапазонах, в которых имеют поглощение и продукты его реакции с а аминокислотами, что существенно усложняет проведение анализа.

Исследование реакции а-аминокислот с 0,2 % водным раствором нингидрина

Для качественного и количественного анализа а-аминокислот достаточно часто используют водный раствор нингидрина [7, 13, 20]. На этом основании нами исследованы спектральные характеристики 0,2 % водного раствора нингидрина после его нагревания при температуре 100 °С в течение 15 мин и установлено, что водный раствор нингидрина имеет интенсивное поглощение в диапазоне длин волн 220-300 нм, но совершенно не поглощает в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм (рис. 11).

Видео по теме